Qu'est-ce que la fluorescence ?

La fluorescence, terme chinois également écrit « yingguang », désigne un phénomène luminescent froid au cours duquel une substance émet de la lumière après avoir été excité par une lumière incidente d'une certaine longueur d'onde — généralement ultraviolette ou rayons X. Lorsqu'une substance à température ambiante absorbe de l'énergie provenant d'une telle lumière incidente, elle entre dans un état excité puis se désexcite immédiatement, émettant ainsi une lumière d'une longueur d'onde plus longue que celle de la lumière incidente (habituellement située dans le spectre visible). Pour nombre de substances fluorescentes, l'émission cesse aussitôt que la lumière incidente est retirée. La lumière émise selon ces caractéristiques est appelée fluorescence. Par ailleurs, certaines substances continuent d'émettre de la lumière pendant une durée relativement longue même après l'extinction de la lumière incidente ; ce phénomène est connu sous le nom de phosphorescence. Dans la vie quotidienne, les gens qualifient souvent de fluorescence tout éclairage faible sans examiner précisément ni distinguer les mécanismes sous-jacents responsables de cette luminescence. Ce terme fait également référence à une lumière froide, dont la température est basse (et non pas la température de couleur).

Le principe de la fluorescence

Lorsque la lumière frappe certains atomes, l'énergie de la lumière fait sauter certains électrons situés autour du noyau atomique de leurs orbites d'origine vers des orbites à plus haute énergie — passant ainsi de l'état fondamental au premier état singulet excité ou au deuxième état singulet excité, et ainsi de suite. Étant donné que le premier état singulet excité ou le deuxième état singulet excité sont instables, ils finissent par revenir à l'état fondamental. Lorsque les électrons retombent du premier état singulet excité vers l'état fondamental, l'énergie excédentaire est libérée sous forme de lumière, produisant ainsi une fluorescence.

La fluorescence est l'émission de lumière par une substance après qu'elle ait absorbé de la lumière ou d'autres radiations électromagnétiques. Dans la plupart des cas, la lumière émise possède une longueur d'onde plus longue et une énergie plus faible que la lumière absorbée. Toutefois, lorsque l'intensité d'absorption est suffisamment élevée, une absorption à deux photons peut se produire, entraînant ainsi un rayonnement émis dont la longueur d'onde est plus courte que celle de la lumière absorbée. Lorsque la longueur d'onde du rayonnement émis correspond à celle de la lumière absorbée, ce phénomène est appelé fluorescence résonante. Un exemple courant est l'absorption de la lumière ultraviolette par une substance, qui émet alors une fluorescence visible. Les lampes fluorescentes que nous utilisons au quotidien fonctionnent sur ce principe : le revêtement phosphorescent à l'intérieur du tube de la lampe absorbe la lumière ultraviolette émise par la vapeur de mercure présente dans le tube et réémet ensuite de la lumière visible, rendant ainsi cette lumière perceptible à l'œil humain.

Paramètres de fluorescence

(1) Spectre d'excitation : La relation entre l'intensité ou l'efficacité de luminescence d'une ligne ou d'une bande d'émission spécifique d'un matériau luminescent et la longueur d'onde de la lumière d'excitation lorsqu'il est éclairé par une lumière de différentes longueurs d'onde.

(2) Spectre d'émission : La variation de l'intensité de la luminescence à différentes longueurs d'onde lorsqu'un matériau luminescent est excité par une lumière d'excitation spécifique.

(3) Intensité de fluorescence : L'intensité de fluorescence est liée à des facteurs tels que le rendement quantique de fluorescence, le coefficient d'extinction et la concentration de la substance.

(4) Rendement quantique de fluorescence Q : Le rendement quantique représente la capacité d'une substance à convertir l'énergie lumineuse absorbée en fluorescence ; il est égal au rapport entre le nombre de photons émis par une substance fluorescente et le nombre de photons absorbés.

(5) Décalage de Stokes : Le décalage de Stokes est la différence entre la longueur d'onde d'émission maximale de fluorescence et la longueur d'onde d'absorption maximale.

(6) Durée de vie de la fluorescence : Lorsqu'un faisceau lumineux excite une substance fluorescente, les molécules du matériau fluorescent absorbent de l'énergie et passent de l'état fondamental à un état excité. Elles émettent ensuite une fluorescence sous forme de rayonnement lorsqu'elles retournent à l'état fondamental. La durée de vie de la fluorescence est définie comme le temps nécessaire pour que l'intensité de fluorescence des molécules diminue jusqu'à 1/e de son intensité maximale au moment où l'excitation cesse.

Les points quantiques de sélénure de cadmium émettent une fluorescence lorsqu'ils sont exposés à la lumière ultraviolette.

Applications de la fluorescence

Éclairage

Lampe fluorescente

Une lampe fluorescente courante en est un excellent exemple. L'intérieur du tube de la lampe est mis sous vide, puis rempli d'une faible quantité de mercure. Lorsqu'une décharge électrique se produit entre les électrodes à l'intérieur du tube, le mercure émet une lumière dans le spectre ultraviolet. Cette lumière ultraviolette est invisible et nocive pour la santé humaine. C'est pourquoi la surface intérieure du tube de la lampe est recouverte d'une substance appelée phosphore (ou matériau fluorescent), qui absorbe la lumière ultraviolette et la réémet sous forme de lumière visible.

Les diodes électroluminescentes (LED) capables d'émettre de la lumière blanche fonctionnent également sur un principe similaire. La lumière émise par les semi-conducteurs est bleue, et cette lumière bleue peut exciter des luminophores – tels que le phosphore – fixés à l'électrode réfléchissante, les faisant ainsi émettre une fluorescence orange. Lorsque ces deux couleurs de lumière sont mélangées, elles se rapprochent de la lumière blanche.

Surligneur

Les surligneurs contiennent des colorants fluorescents qui produisent un effet fluorescent lorsqu'ils sont exposés à la lumière ultraviolette — comme la lumière du soleil, les lampes de jour ou les lampes au mercure. Sous éclairage UV, ces surligneurs émettent une lumière blanche, donnant aux couleurs un aspect fluorescent et éclatant. La fluorescence des surligneurs diffère de celle des montres ou des bâtons lumineux : les bâtons lumineux reposent sur une réaction radioactive interne qui génère des radiations, lesquelles excitent à leur tour la poudre fluorescente environnante pour qu'elle émette de la lumière. Ainsi, les bâtons lumineux peuvent continuer à briller même en l'absence de toute lumière UV la nuit. En revanche, les surligneurs ne présentent une fluorescence que lorsqu'ils sont exposés à la lumière UV. Vous pouvez facilement le vérifier en approchant la marque du surligneur d'un piège à moustiques ou d'un détecteur de billets de banque — tous deux émettant de la lumière UV.

Biochimique et médical

La fluorescence possède de nombreuses applications dans les domaines de la biochimie et de la médecine. Grâce à des réactions chimiques, des groupes chimiques fluorescents peuvent être fixés à des biomolécules ; ces biomolécules peuvent ensuite être détectées avec une grande sensibilité en observant la fluorescence émise par les groupes marqués.

Profil de séquençage de l'ADN obtenu à l'aide d'un agent de terminaison de chaîne marqué par fluorescence.

La méthode de terminaison de chaîne pour le séquençage automatisé de l'ADN : Dans la méthode originale, les extrémités des amorces d'ADN devaient être marquées par des colorants fluorescents afin de permettre une identification précise des bandes d'ADN sur le gel de séquençage. Dans la méthode améliorée, les quatre types de didéoxynucléotides (ddNTP) — qui servent de terminateurs de chaîne — sont chacun marqués individuellement par des colorants fluorescents. Après électrophorèse, les molécules d'ADN de longueurs différentes se séparent selon leur taille. Lorsqu'elles sont exposées à la lumière ultraviolette, les quatre didéoxynucléotides marqués différemment émettent une fluorescence à des longueurs d'onde distinctes. En analysant le spectre de fluorescence, la séquence d'ADN peut être déterminée avec précision. Détection de l'ADN : Le bromure d'éthidium est un colorant fluorescent qui émet une fluorescence très faible lorsqu'il change librement de conformation en solution. Cependant, dès qu'il s'intercale entre les paires de bases dans la double hélice des acides nucléiques et se lie aux molécules d'ADN, il produit une fluorescence intense. C'est pourquoi le bromure d'éthidium est couramment ajouté lors de l'électrophorèse sur gel pour colorer l'ADN. Puces à ADN (bio-puces) : Les sondes génomiques doivent être marquées par des colorants fluorescents, et les séquences cibles sont finalement identifiées en analysant les signaux fluorescents obtenus. Dosage immunofluorescent en immunologie : Les anticorps sont marqués par des colorants fluorescents, ce qui permet aux chercheurs de déterminer la localisation et la nature des antigènes grâce à la distribution et à la morphologie de la fluorescence. Cytométrie en flux (également appelée triage cellulaire activé par fluorescence, FACS) : Les cellules échantillon sont marquées par des colorants fluorescents, puis excitées par des faisceaux laser afin de produire une fluorescence spécifique. La fluorescence émise est détectée par un système optique et transmise à un ordinateur pour analyse, révélant ainsi diverses caractéristiques des cellules. La technologie de fluorescence est également appliquée pour détecter et analyser les structures moléculaires de l'ADN et des protéines, notamment celles des macromolécules biologiques complexes. La protéine luminescente de méduse a été isolée pour la première fois à partir de l'organisme marin Aequorea victoria. En présence d'ions calcium, elle émet une fluorescence verte. Cette propriété a été exploitée pour observer en temps réel le mouvement des ions calcium à l'intérieur des cellules. La découverte de la protéine luminescente de méduse a stimulé de nouvelles recherches sur les méduses marines et a conduit à l'identification de la protéine fluorescente verte (GFP). La chaîne polypeptidique de la GFP contient une structure chromophore unique qui lui permet d'émettre une fluorescence verte stable lorsqu'elle est exposée à la lumière ultraviolette, sans nécessiter de cofacteurs supplémentaires ni de traitements spéciaux. Par conséquent, la GFP et les protéines apparentées sont devenues des outils essentiels dans la recherche en biochimie et en biologie cellulaire. Microscopie à fluorescence : La microscopie à fluorescence par réflexion totale interne — de nombreuses biomolécules possèdent une fluorescence intrinsèque et peuvent émettre une fluorescence sans avoir besoin de groupes chimiques supplémentaires. Parfois, cette fluorescence intrinsèque peut changer en réponse aux conditions environnementales, ce qui permet d'utiliser cette sensibilité à l'environnement pour détecter la distribution et les propriétés des molécules. Par exemple, la bilirubine, lorsqu'elle se lie à un site spécifique de l'albumine sérique, émet une fluorescence intense. De même, lorsque les globules rouges manquent de fer ou contiennent du plomb, ils produisent de la protoporphyrine zinc au lieu de l'hème normal (hémoglobine) ; la protoporphyrine zinc présente une fluorescence intense et peut ainsi être utilisée pour aider à identifier la cause sous-jacente de certaines maladies.

Gemmologie, minéraux

Les gemmes, minéraux, fibres et autres matériaux pouvant servir de preuves médico-légales peuvent émettre une fluorescence aux caractéristiques variées lorsqu'ils sont exposés à un rayonnement ultraviolet ou à des rayons X.

Les rubis, les émeraudes et les diamants peuvent émettre une fluorescence rouge sous une lumière ultraviolette à courte longueur d'onde. Les émeraudes, le topaze (jade jaune) et les perles peuvent également fluorescer sous la lumière ultraviolette. De plus, les diamants peuvent présenter une phosphorescence sous les rayons X.

Distinction conceptuelle

La luminescence induite par l'excitation par la lumière (généralement des rayons ultraviolets ou des rayons X) est appelée photoluminescence ; elle englobe des phénomènes tels que la fluorescence et la phosphorescence. La luminescence provoquée par des réactions chimiques est connue sous le nom de chimiluminescence ; les bâtons fluorescents utilisés lors des concerts émettent de la lumière grâce à une réaction chimique déclenchée par le mélange de deux produits chimiques liquides. La luminescence induite par les rayons cathodiques (un faisceau d'électrons à haute énergie) est appelée cathodoluminescence — c'est précisément ainsi que l'écran fluorescent du tube cathodique d'un téléviseur émet de la lumière. Le phénomène de luminescence froide chez les organismes vivants est appelé bioluminescence ; par exemple, la lumière émise par les lucioles est désignée sous le terme « yingguang ». Dans la langue chinoise ancienne, le caractère « ying » était utilisé indifféremment avec « ying », et dans certaines régions où l'on parle chinois, le caractère « ying » est spécifiquement associé aux insectes. À Taïwan, la fluorescence est souvent désignée sous le nom de « yingguang » ; en Chine continentale, on parle plutôt de « yingguang », tandis que « yingguang » fait généralement référence plus précisément à la lumière émise par les lucioles.

Instrument

La mesure de fluorescence nécessite absolument un instrument. L'instrument couramment utilisé pour détecter la quantité de fluorescence contenue dans une substance s'appelle un spectrophotomètre de fluorescence.

La structure de base d'un analyseur de fluorescence comprend : une source de lumière d'excitation, un monochromateur d'excitation, une chambre à échantillon, un monochromateur d'émission et un système de détection.