Un microscope à fluorescence est un type de microscope optique. Lorsque l'échantillon observé est transparent ou que ses structures internes ne peuvent pas être clairement distinguées par la couleur, le microscope à fluorescence constitue un excellent choix, car il permet de surmonter les limitations des microscopes ordinaires lors de l'observation de matériaux transparents. Le principe du microscope à fluorescence repose sur l'illumination d'un échantillon teint avec un colorant fluorescent à l'aide de lumière de courte longueur d'onde, ce qui excite les molécules du colorant et les fait émettre une fluorescence de longue longueur d'onde. Cela permet aux observateurs d'examiner la structure interne de l'échantillon. Dans un microscope à fluorescence, il est essentiel de sélectionner des longueurs d'onde spécifiques de la lumière d'excitation provenant de la source d'éclairage afin de générer la fluorescence. Par la suite, il convient de séparer cette fluorescence de la lumière mixte composée à la fois de la lumière d'excitation et de la fluorescence émise, afin de pouvoir l'observer clairement. Ainsi, les systèmes de filtres qui transmettent sélectivement certaines longueurs d'onde jouent un rôle extrêmement important dans ce processus. Les microscopes à fluorescence sont largement utilisés dans des domaines tels que la biologie et la médecine.
Un microscope à fluorescence est composé des éléments de base suivants :
a. Source lumineuse : Généralement une lampe à arc au xénon ou une lampe au mercure, mais des LED de forte puissance ont également été utilisées ces dernières années.
b. Filtre (lumière incidente) : Ce filtre réduit la longueur d'onde de la lumière incidente afin de ne laisser passer que la longueur d'onde nécessaire pour exciter l'échantillon ; curieusement, il est appelé filtre d'excitation.
c. Miroir ou réflecteur dichroïque à deux voies : Il réfléchit la lumière d'excitation vers l'échantillon tout en transmettant simultanément uniquement la lumière d'émission issue de l'échantillon vers le détecteur (comme illustré sur la figure ci-dessous).
d. Filtre d'émission : Il ne laisse passer que les longueurs d'onde d'émission provenant de l'échantillon, tout en bloquant toute la lumière ayant traversé le filtre d'excitation. Comme vous pouvez vous y attendre, il est appelé filtre d'émission.
e. Caméra CCD : Si la lumière émise ne peut pas être détectée, la caméra est totalement inutile. Pour l'imagerie par fluorescence, le détecteur est généralement une caméra CCD, qui est habituellement connectée à un écran d'ordinateur et peut afficher l'image pour vous.
Un séparateur de faisceau dichroïque permet à la lumière de plus longues longueurs d'onde de passer à travers le filtre tout en réfléchissant la lumière de plus courtes longueurs d'onde.
Classification des microscopes à fluorescence :
Les microscopes à fluorescence se divisent généralement en deux types : à lumière transmise et à lumière réfléchie.
a. Type de transmission : La lumière d'excitation provient de sous l'échantillon, et le condenseur est un condenseur en champ sombre, qui empêche la lumière d'excitation de pénétrer dans l'objectif tout en permettant à la fluorescence d'y entrer. À faible grossissement, l'image apparaît lumineuse ; à fort grossissement, elle devient sombre. Ce type d'éclairage est relativement difficile à régler lorsqu'on utilise l'immersion à l'huile ou qu'on centre le microscope, notamment pour déterminer la plage d'éclairage appropriée à faible grossissement. Cependant, il peut produire un fond très sombre pour l'échantillon. La méthode d'éclairage par transmission ne convient pas aux échantillons qui ne sont pas transparents.
b. Éclairage par épillumination : Bien que la microscopie à lumière transmise ait été largement abandonnée, la plupart des microscopes à fluorescence modernes utilisent désormais l'éclairage par épillumination. Dans cette configuration, la source de lumière est placée au-dessus de l'échantillon, et un séparateur de faisceau est intégré dans le trajet optique, ce qui le rend adapté aussi bien aux échantillons transparents qu'aux échantillons opaques. Puisque l'objectif joue le rôle d'un condenseur, cette configuration simplifie non seulement l'opération, mais garantit également un éclairage uniforme sur tout le champ de vision, depuis les faibles jusqu'aux forts grossissements.
